发表期刊：Cell Reports
影响因子：9.995
发表时间：2022年10月25日
研究方法：m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pull down
文章链接：m6A modification confers thermal vulnerability to HPV E7 oncotranscripts via reverse regulation of its reader protein IGF2BP1 upon heat stress
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1. 热应激下调HPV16 E7 mRNA稳定性
为了初步评估E7的热敏性，作者使用了HPV16阳性的CaSki和SiHa细胞，发现热应激以时间和温度依赖性的方式显著下调了E7蛋白及其mRNA的水平（图1A-B）。无论是蛋白酶体抑制剂MG132，还是溶酶体抑制剂氯喹（CQ）均不能挽救热处理导致的E7蛋白的下调（图1C-D），这表明热应激介导的E7 mRNA的下调是E7癌蛋白水平降低的主要原因。此外，作者发现在CaSki或SiHa移植的斑马鱼（图1G）和裸鼠（图1H）中，热处理后E7 mRNA水平下调。热处理也显著降低了hpv16阳性患者肿瘤样本中的E7 mRNA水平（图1I），这表明通过热处理来降低HPV16阳性肿瘤中的E7具有临床潜力。
2. 热应激以m6A依赖的方式下调HPV16 E7 mRNA稳定性
由于m6A修饰是RNA代谢的关键调控因子，作者研究了m6A修饰是否参与了热诱导的E7 mRNA的下调。首先，作者使用SRAMP预测了产生E7癌蛋白的主要转录本HPV16 E6*1上三个潜在的m6A位点簇（C1、C1和C3）（图2A）。MeRIP-qPCR结果证实了在CaSki（图2B）和SiHa细胞（图2C）以及6例HPV16阳性患者的肿瘤样本中存在这些m6A位点簇。由于m6A修饰主要是由METTL3/METTL14复合物催化，作者用siRNAs敲除METTL14，发现E7转录本上的m6A水平显著降低，同时E7 mRNA及其蛋白表达水平下调（图2D）。这些结果表明，m6A对E7 mRNA的稳定性至关重要。重要的是，MeRIP-qPCR结果显示热应激显著降低了E7 mRNA上m6A修饰，而LC-MS/MS整体甲基化水平检测发现整体m6A水平无显著变化（图2E-F）。同样，m6A MeRIP-seq结果显示其他mRNA，包括CREBBP、RAB21和FBXO41的m6A水平不受温度升高的影响，进一步表明热应激选择性地降低E7 mRNA稳定性。接下来，作者为了进一步确定负责热敏感性的关键m6A位点，构建了一系列E7 mRNA的m6A位点特异性突变转录本（图2G）。结果发现，含有m6A位点簇C3突变的m7 mRNA的稳定性远低于完整C3区，且热处理只下调了具有完整C3区域的E7转录本及其蛋白产物（图2H-I）。综上所述，C3区m6A的修饰对E7 mRNA的稳定至关重要，并在热应激介导的E7 mRNA及其蛋白产物的下调中发挥了关键作用。
3. 热处理特异性下调E7 mRNA-IGF2BP1致癌复合物稳定性
接下来，作者研究了热处理通过m6A下调E7 mRNA的机制。通过评估高温对主要的m6A修饰酶的影响，作者发现只有m6A reader蛋白IGF2BP1在热应激下显著降低（图3A）。MeRIP-qPCR结果显示沉默IGF2BP1显著降低了E7 mRNA上的m6A水平，同时E7 mRNA和蛋白水平显著降低（图3B）。IGF2BP1的过表达稳定E7 mRNA，而IGF2BP1的缺失使E7 mRNA不稳定（图3C）。此外，RIP-qPCR以及RNA pulldown-WB的结果显示WT-IGF2BP1，而不是m6A结合缺陷的突变体mut-IGF2BP1结合、稳定并增加了E7 mRNA和蛋白的水平，支持了IGF2BP1以m6A依赖的方式调节E7 mRNA的稳定性的观点。在热处理后，IGF2BP1迅速从可溶性提取物转变为不可溶性颗粒组分随之泛素化，且E7的消耗在很大程度上抑制了热应激下可溶性IGF2BP1的减少（图3E），这表明IGF2BP1的不稳定可能是由于热诱导的E7依赖的IGF2BP1聚集造成的（图3E-F）。RIP-qPCR结果显示热处理后，E7 mRNA与IGF2BP1的相互作用迅速增强，然后逐渐减少。PLA检测显示IGF2BP1的热刺激泛素化只发生在WT E7表达细胞中，而不是在E7缺失或m6A突变体（m-C3）E7表达细胞中（图3H），支持了热介导的IGF2BP1泛素化是通过m6A修饰的E7 mRNA依赖的方式诱导的观点。与RNA-PLA的结果一致，GFP IGF2BP1在热处理后迅速形成了显微镜下可见的颗粒（图3J）。
4. 每日热处理可下调E7和IGF2BP1，并降低HPV阳性细胞的致瘤潜能
接下来，作者探讨了热应激介导的作用是否能抑制HPV16阳性细胞的恶性肿瘤。研究表明，每日短期（30 min）轻度热处理足以下调E7 mRNA及其E7蛋白产物和IGF2BP1蛋白水平，抑制RB和p53蛋白表达，导致p21（p53靶基因）表达上调，PCNA（E2F靶基因）表达下调，减少HPV16阳性细胞增殖和迁移（图4A-E）。值得注意的是，仅在IGF2BP1和WT E7表达的细胞中观察到热诱导p21上调、PCNA下调、细胞增殖和迁移减少，而在E7阴性、m6A突变（m-C3）E7和IGF2BP1敲降（IGF2BP1 KD）C33A细胞中未发现（图4F-G），表明这些热介导的恶性抑制作用依赖于IGF2BP1和m6A修饰的E7 mRNA。接下来，作者建立了异种移植小鼠模型，并检测了每日热处理30天的效果（图4H）。结果显示，每日热处理SiHa而不是C33A异种移植小鼠，显著抑制肿瘤生长和细胞增殖，下调E7 mRNA、E7蛋白和IGF2BP1蛋白，以及上调RB和p21蛋白（图4H-K）。综上所述，每日轻度热处理可下调E7，抑制肿瘤发生，提示其具有临床潜力。
作者通过m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pulldown等一系列实验发现在感染HPV的细胞中，病毒E7 mRNA被N6-甲基腺苷（m6A）修饰，并被reader蛋白IGF2BP1稳定。此外，本文研究发现，热处理选择性地破坏m6A修饰的HPV E7 mRNA，反向调节IGF2BP1，从而抑制E7介导的HPV阳性细胞的恶性肿瘤。
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
- m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA测序
- m6A miRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。05 机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
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