克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条。1963年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（Clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中。
克隆技术又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，又称重组DNA技术，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
随着分子生物学研究的不断深入，分子克隆技术也随之更新迭代，从传统的依赖限制性内切酶的方法发展到如今的TA克隆、TOPO克隆、无缝克隆、Gateway技术等等，新的技术不断涌现，为分子生物学的发展和进化提供新的力量。今天小翌就带领大家认识一下不同的分子克隆方法。
01 传统分子克隆技术
传统分子克隆技术的依赖于限制性内切酶和酶切位点。主要步骤是通过限制性内切酶（翌圣的FuniCut™快速限制性内切酶Cat#15001ES-15051ES）酶切载体和目的基因，通过连接酶（翌圣T4 DNA连接酶Cat#10300）将酶切的片段拼接在一起（即连接过程），形成可以表达目的基因的新载体（即重组质粒），使用转化技术转化至感受态细胞中，进而实现目的基因的扩增、转录和翻译。
传统分子克隆实验流程如下图：
图1.传统分子克隆实验流程
该技术最早由Cohen Group在1973年实现，他们将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer，实现了细菌遗传性状的转移。传统分子克隆技术较为成熟，但是该方法受到限制性酶切位点和连接效率等方面的限制，并不能高效、准确的克隆需要的目的基因。
图2. Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一个成功实现基因工程技术的团队）
02 TA克隆
图3. TA克隆流程示意图【3】
03 TOPO克隆
图4. TOPO克隆原理
图5. TOPO TA/Blunt克隆试剂盒轻松连接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段
注：A&B：TOPO克隆转化平板。C&D：插入片段PCR鉴定电泳图。
04无缝克隆技术
图6.同源重组原理
Gibson Assembly：包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三种酶，通过5’→3’ T5核酸外切酶活性，沿着5’→3’方向降解dsDNA，产生3’黏性末端，通过同源臂互补配对，退火后借助Phusion DNA聚合酶修复片段上的缺口，Taq DNA连接酶催化片段形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐，获得重组片段。
图7. Gibson Assembly原理图【5】
图8. In-Fusion Cloning原理【6】
05相关产品列表
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产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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通用缓冲液，5min完成精准酶切 |
FuniCut™快速限制性内切酶 |
50 T |
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常规PCR |
2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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常规PCR，不含染料 |
2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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快速PCR，快至1s/kb |
2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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TOPO克隆-兼容TA/平末端 |
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |
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TOPO克隆-TA末端 |
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒 |
20 T |
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TOPO克隆-平末端 |
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit |
20 T |
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单片段一步克隆，已发文章累计IF达到1000+ |
Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒 |
10911ES20/50 |
20 T/50 T |
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1-6片段一步克隆，最快5分钟完成重组反应 |
Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆试剂盒 |
20 T/50 T |
参考文献
1.Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(1), 189-193.
2.Holton TA, Graham MW. A Simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J]. Nucleic Acids Ｒes, 1991, 19(5), 1156.
3.Clark D P, Pazdernik N J, Mcgehee M R. Cloning Genes for Synthetic Biology - ScienceDirect[J]. Molecular Biology (Third Edition), 2019:199-239.
4.Seki T, Seki M, Onodera Ｒ, et al. Cloning of cDNA encoding a novel mouse DNA topoisomerase III (Topo IIIbeta) possessing negatively supercoiled DNA relaxing activity, whose message is highly expressed in the testis[J]. J Biol Chem, 1998, 273 (44): 28553-28556.
5.Gibson DG, Young L, Chuang ＲY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nat Methods, 2009, 6( 5) : 343-345.
6.张阳璞,杨淑慎.几种新型植物基因表达载体的构建方法[J].生物工程学报,2015,31(03):311-327.