肿瘤异质性是癌症进展和治疗抵抗的主要驱动因素之一。据推测，癌细胞亚群之间的合作对于维持异质性和促进肿瘤进展至关重要。然而，这种合作如何发生仍然难以捉摸。
细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的中心介质。癌症EVs具有很多功能，如促进癌症相关成纤维细胞的分化，增强血管生成，调节抗肿瘤免疫应答，建立转移前生态位并赋予非转移性癌细胞转移等特性。然而，具有不同表型和肿瘤形成能力的癌细胞亚群之间EVs的交换与交流的问题尚未得到解决。
2022年1月来自葡萄牙波尔图大学的研究团队在Gut（IF=23.059）上发表了题为“Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumour progression”的文章，首次揭示了由胰腺癌干细胞（CSC）细胞外囊泡领导的有组织的通信网络，并展示了其在肿瘤生物学中的重要性。再通过蛋白质组学发现CSC中特异性表达的agrin，通过agrin/LRP-4/YAP通路影响肿瘤进展，并证明了agrin可作为胰腺癌治疗干预的潜在新靶点，也可用于预测胰腺癌预后。
研究材料
人胰腺癌细胞；胰腺导管腺癌原位模型；患者衍生的异种移植物模型；基因工程小鼠模型；PDAC患者的血清样本
技术路线
· 步骤1：构建荧光标记EVs的克隆，研究细胞亚群之间EVs的流动；
· 步骤2：改变微环境，研究EVNet的变化；
· 步骤3：构建动物模型，抑制EVs形成，研究破坏EVNet对肿瘤进展的影响；
· 步骤4：构建模型，比较CSC和NSCC分泌的EVs对肿瘤进展的影响；
· 步骤5：通过蛋白质组学研究CSC EVs影响肿瘤进展的原因；
· 步骤6：验证agrin可作为胰腺癌治疗的新靶点；
· 步骤7：发现并验证循环agrin阳性EVs是疾病进展的预后标志物。
研究结果
1. 细胞外囊泡在癌细胞亚群之间自发流动
首先，研究人员在人胰腺癌细胞中建立了四种不同荧光标记EVs的稳定克隆，又基于细胞表面标志物的表达，从每种克隆中分别分选出一种特定的细胞亚群，两种是以胰腺癌干细胞（CSC，与PADC的不良预后相关）为特征的罕见亚群，CD133+细胞和CD24+CD44+细胞；另外两种是占据大多数的非干细胞（NSCC）亚群，CD24−CD44+细胞和4N (CD133−CD24−CD44−EpCAM−)细胞。将这四种细胞亚群混合培养，通过共聚焦成像分析研究EVs在细胞亚群之间的流动。研究发现，69.56%±11.92%的细胞对其他亚群的EVs呈阳性，表明癌症EVs在它们之间自发流动，且流动方向以干细胞（CSC）到非干细胞（NSCC）为主，并排除了分泌的EVs数量、降解速率或细胞亚群的内吞能力的影响。综上，胰腺癌细胞亚群通过细胞外囊泡的自发流动，构建了一个有组织的细胞间通讯网络（EVNet）。
图1 PDAC癌细胞亚群之间EVs的流动
2. EVNet有助于癌细胞适应微环境
接下来，研究人员探讨了改变微环境的情况下EVNet是否受到影响。结果发现，缺氧使得细胞间的通讯频率显著增加，EVs流动方向仍以 （CSC）到（NSCC）为主。而化疗引起EVs流动方向改变，非干细胞亚群之间的通讯频率显著增加。这表明EVNet是具有可塑性的，在面对微环境的挑战时，会改变通讯速度甚至路线。
Rab27a参与细胞外囊泡的形成，敲除Rab27a后，细胞外囊泡分泌减少，缺氧和化疗让胰腺癌细胞死亡比例显著升高。因此，细胞外囊泡通讯有助于癌细胞适应微环境变化。
图2 微环境改变对EVNet的影响
3. 破坏EVNet会阻碍肿瘤生长
为了进一步研究EVNet的生物学作用，研究人员构建了Rab27a功能缺失型胰腺癌鼠模型，发现通过多四环素治疗的小鼠肿瘤生长减缓，肝脏大转移数量显著减少，但组织学上没有差异。接下来，用Rab27a的特异性小分子抑制剂Nexinhib20处理两种动物模型（KPC、PDXs），来抑制EVs的分泌。结果显示Nexinhib20处理后，KPC存活率显著提高，PDXs肿瘤生长减缓。综合表明Rab27a敲低会损害EVs介导的通讯，从而阻止癌症的进展。
图3 EVNet对肿瘤生长的影响
4. CSC分泌的 EVs是影响PDAC进展的原因
由于EVNet中最常见的通讯路径是从CSC到NSCC，故特异性地去抑制CSC的EVs的通讯作用，从而研究其在生物学中的作用。首先从Rab27a敲低组和对照组中分别分离出CSC和NSCC细胞亚群，交叉混合后再原位移植到小鼠中，构建Rab27a敲低的CSC小鼠模型和NSCC小鼠模型。研究发现，Rab27a敲低的CSC小鼠模型中，多四环素喂养的小鼠肿瘤生长缓慢，重量显著降低；而Rab27a敲低的NSCC小鼠模型中，无显著变化。表明敲低CSC中的Rab27a，抑制其通讯能力，才是影响肿瘤生长的原因。
图4 CSC和NSCC通讯功能差异比较
5. CSC EVs具有独特的蛋白质组成并且富含agrin，促进肿瘤进展
为了找到CSC EVs如此特别的原因，研究人员采用labelfree蛋白质组学对四种人PDAC细胞系的癌细胞亚群及其分泌的EVs分别进行检测。通过一系列生物信息学比较分析细胞和外泌体，CSC和NSCC之间的蛋白表达及功能差异，发现CSC EVs和NSCC EVs的蛋白质组成有非常大的差异，仅在CSC EVs中检测到的大量蛋白质与PDAC发生发展过程密切相关，例如轴突导向通路，其中agrin是最富集的蛋白质之一。
在肝癌中，agrin通过与LRP-4受体结合激活YAP转录因子来促进肝癌发生。研究人员在胰腺癌细胞中也验证了此通路的存在，证明了CSC EVs中的agrin促进YAP活化，促进癌细胞的增殖和存活率。
图5 CSC和NSCC EVs蛋白质表达及功能比较
6. Agrin是PDAC中CSC的潜在治疗靶点
上文已经证明了敲低Rab27a来抑制CSC中EVs的分泌可以抑制肿瘤生长，接下来，研究人员又试图评估CSC EVs中特异性表达的agrin下调是否会对疾病进展产生影响。先从agrin敲低和对照组的细胞中分离出CSC和NSCC，再交叉混合移植到小鼠中，研究发现CSC中agrin下调会导致肿瘤生长减慢，肿瘤体积减小。在构建的agrin敲低的KPC模型（KPAC）中，与KPC小鼠相比，显示出延迟的疾病进展，同时YAP表达显著下调。以上实验证明了agrin是胰腺癌治疗干预的新靶点。
图6 阻断agrin的表达对疾病进展的影响
7. 循环agrin阳性EVs是疾病进展的预后标志物
最后，研究人员收集了44名胰腺癌患者的110例血液样本，通过成像流式细胞术鉴定EV中agrin的表达，证明了cAGRN+EV的百分比与肿瘤负荷呈正比；其次发现了cAGRN+EVs和cCD133+EVs（来源于CSC）的百分比之间有显著的相关性，进一步证明了cAGRN+EVs的来源；最重要的是，在没有手术的患者中，cAGRN+EVs每增加1%，使疾病进展的风险增加2.94倍。
又通过受试者特征曲线（ROC）分析研究发现循环agrin阳性EVs可作为未接受手术的患者疾病进展的特异性和敏感性的生物标志物，与cCD133+EVs组合会提高预测疾病进展的准确性。
图7 疾病进程中循环agrin阳性EVs的变化
小编小结
肿瘤是不同癌细胞亚群组成的复杂实体。癌细胞亚群之间会通过EVs进行通讯交流，且这种通信对于癌细胞克服微环境变化和茁壮成长至关重要。本文的工作表明，胰腺癌细胞亚群通过富含agrin的CSC EVs建立了一个有组织的，具有可塑性的通信网络EVNet。同时发现了agrin可作为胰腺癌治疗干预的潜在新靶点，并在PDAC临床样本中，证实了cAGRN+EV是疾病进展的预后生物标志物，具有深远的临床意义。
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