近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）提高了我们对皮肤生物学的理解。但对新鲜样本的需求、不完全解离导致的细胞损失或死亡，以及组织消化过程中的刺激作用都使scRNA-seq的实用性受到了限制。而单核RNA测序（snRNA-seq）可以应用于冷冻的、难以解离的样本，这或许是可以绕过scRNA-seq对皮肤组织限制的一个途径。

分析比对snRNA-seq和scRNA-seq在检测皮肤细胞时的效果差异。

本研究对一个人的等分皮肤样本进行了snRNA-seq和scRNA-seq并行检测（单细胞测序技术服务由伯豪生物提供），并整合了先前发表的scRNA-seq数据，分析比较了两种方法在细胞比例和基因表达方面的差异。另外，通过Slingshot方法分析了角质形成细胞和成纤维细胞的分化轨迹。

1. scRNA-seq检测到数量更多的细胞和基因，尤其是免疫相关基因，而snRNA-seq受线粒体污染的影响较小，检测到更多种类转录因子。

scRNA-seq中定位到外显子区域的读数的比例为56.4%，显著高于snRNA-seq，其中读数更多地定位到内含子区域；scRNA-seq中的counts或基因数量高于snRNA-seq，但是snRNA-seq中每个细胞的线粒体读数的平均百分比低于scRNA-seq；对scRNA-seq和snRNA-seq中前100个高度可变基因的GO富集分析表明，snRNA-seq鉴定出更多与表皮发育相关的基因，而scRNA-seq则鉴定出更多的与免疫功能相关的基因；通过分析scRNA-seq和snRNA-seq检测到的转录因子的差异，发现snRNA-seq可以检测到更多的转录因子差异表达。

2 . snRNA-seq和scRNA-seq在检测细胞类型方面存在差异

由于scRNA-seq的不同消化方案可能导致细胞比例的变化，研究整合了已发表文章中健康皮肤的scRNA-seq数据进行比较分析。使用这些综合数据，鉴定出了13个细胞类型簇。研究使用已知的特征基因确定了每个簇的同一性；snRNA-seq对角质形成细胞和成纤维细胞的检测更有效，而scRNA-seq检测出更多种类的免疫细胞；消化时间和不同类型的消化酶对scRNA-seq中的细胞活性和基因表达有不同的影响。在He等人的数据中，用混合酶消化整个皮肤，与本研究的scRNA-seq和Reynolds等人的数据相比，获得了更多的角质形成细胞和角质形成细胞亚群。本研究和Reynolds等人在37°C下使用胶原酶IV过夜对真皮进行了消化，则获得了大量的免疫细胞和FIB1。相反，He等人的消化时间很短，成纤维细胞亚群和免疫细胞的百分比更接近snRNA-seq.

3. snRNA-seq揭示了更多与角质形成细胞功能相关的细胞簇

本研究基于snRNA-seq的结果，对角质形成细胞进行了二级无监督聚类，并通过特征基因和GO富集分析鉴定了8个亚聚类。皮肤形态发生相关的“基底”（高表达COL17A1、KRT15和KRT14）细胞；角质形成细胞分化和角质形成相关的“棘状”（高表达KRT1和中等表达KRT10）和“颗粒状”（高度表达LOR、FLG和SPINK5）；参与细胞连接组装的 “通道间隙”（表达GJB2和GJB6）细胞；ATP代谢，调节细胞连接的离子通道相关的“通道ATP酶”（表达ATP1A1和P1B1）细胞；角质形成细胞分化和细胞连接的过程相关“毛囊（外根鞘）”（表达KRT6A、KRT6B和KRT17）细胞；脂肪酸代谢以分泌皮脂相关的“毛囊（内鞘（IR）-皮脂腺）”（表达KRT79、ELOVL5和FASN）细胞；有丝分裂核分裂相关的“有丝分裂”（表达UBE2C、TOP2A和MKI67）。这些亚群很好地概括了角质形成细胞的空间和功能聚类；利用snRNA-seq中角质形成细胞亚群的分群方法对scRNA-seq数据进行处理，发现两种方法中，角质形成细胞子群的比例不平衡。在scRNA-seq数据集中，功能性角质形成细胞的比例显著降低，包括“通道ATP酶”、“通道间隙”、“棘状”和“有丝分裂”细胞。

4. snRNA-seq鉴定出调控角质形成细胞分化的基因

由于角质形成细胞的分化状态与亚群密切相关，本研究通过伪时间分析探究了角质形成细胞分化过程。“基底”细胞被定义为起点，五个谱系被识别为代表不同的轨迹。沿着这些轨迹，本研究发现了代表角质形成细胞分化特定阶段的新标志物。例如，LYPD3和EMP2的表达随着角质形成细胞的角质化而增加；CSTB主要在毛囊外根鞘周围的角质形成细胞中表达；结合人类蛋白质图谱（HPA）数据库，证实了这些基因在原位皮肤中的蛋白质表达与转录组分析一致；“基底”和“毛囊（外根鞘）”细胞高表达NFIB，用于维持干细胞特性并调节细胞周期；GRHL1在分化轨迹末端表达逐渐增多，表明其参与角质形成细胞的功能分化。在HPA数据库中，NFIB主要在正常皮肤和基底细胞癌（BCC）的“基底”角质形成细胞中表达。GRHL1在正常皮肤的基底上角质形成细胞中表达，但在cSCC中不表达。

5. snRNA-seq揭示稳态下的人类成纤维细胞图谱

由于成纤维细胞在解离过程中会发生显著变化，本研究在集成数据集上进行了二级无监督聚类，进一步的确定了其异质性；与scRNA-seq相比，snRNA-seq中的亚簇数量显著较低；根据位置和功能（分泌性乳头状细胞、分泌性网状细胞、间充质细胞和促炎细胞），并结合最近提出的四个亚群的特征基因，进一步定义了成纤维细胞的亚群；促炎性成纤维细胞的基因表达特征主要局限于C1-C5中的成纤维细胞，且仅在scRNA-seq数据中发现，表明酶消化可能激活成纤维细胞并诱导炎症表型。C1和C3具有乳头状成纤维细胞的特征；C2主要表现为网状成纤维细胞的特征；C4和C8主要表现出间充质特征。C0、C6和C9主要存在于snRNA-seq数据中。这三个亚群共享Pi16+成纤维细胞祖细胞。C7高表达PI16和DPT，这是泛成纤维细胞祖细胞的两个标志物，并被选为成纤维细胞轨迹分析的起点。Slingshot谱系推断确定了从PI16+簇中出现并在两个方向上结束的五个轨迹：稳定簇或激活簇，表示皮肤成纤维细胞在稳定或激活状态下的分化轨迹。状态特异性特化成纤维细胞与分级聚类分析完全一致，表明scRNA-seq中的单细胞分离可能导致成纤维细胞的炎症激活，而snRNA-seq反映了成纤维细胞在原位的稳定状态。

6. scRNA-seq和snRNA-seq在识别皮肤中的免疫细胞方面是互补的：scRNA-seq具有更大的检测免疫细胞的能力；而snRNA-seq在检测某些稀有细胞方面更为优越

本研究分析了包括DC、巨噬细胞和T细胞在内的主要免疫细胞基因表达的变化。scRNA-seq和snRNA-seq都揭示了DC和巨噬细胞中常见的抗原呈递细胞（APC）功能，包括细胞因子产生、白细胞趋化性和T细胞活化的阳性调节。然而，scRNA-seq展现出更多的免疫相关功能，如“对脂多糖的反应”，并且该GO术语中的大多数基因编码有效或功能性分子。scRNA-seq还鉴定出比snRNA-seq数量高得多的CCR7⁺CD40⁺迁移APC，但几乎没有检测到任何LC；而snRNA-seq可以鉴定少量的LC；研究还发现，scRNA-seq和snRNA-seq都检测出大量与T细胞功能相关的生物学过程。其中，scRNA-seq鉴定了罕见的驻留T细胞。编码分泌细胞因子、表面标记物和转录因子（RORA除外）的T细胞亚群相关基因的丰度在scRNA-seq数据集中远高于snRNA-seq。

在对皮肤组织的研究中，snRNA-seq不太容易受到线粒体和核糖体RNA的污染，并能检测到更多种类的转录因子；通过这些有别与scRNA-seq的结果，可以对细胞亚群的功能性进行更深入的研究。相较于scRNA-seq的组织解离带来的刺激，snRNA-seq可以检测出稳态环境下的转录组特征。在检测免疫细胞方面，scRNA-seq具有更大的检测免疫细胞的能力；而snRNA-seq在检测某些稀有细胞方面更为优越。

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https://www.jdsjournal.com/article/S0923-1811(23)00145-7/fulltext