由于在诱导间充质干细胞(MSCs)向软骨和骨室的空间、定向和可控分化方面存在困难，分级骨软骨单位的再生具有挑战性。新兴的类器官技术为骨软骨再生提供了新的机会。利用特制的微凝胶产生自组装软骨类器官的新方法为推进组织工程领域提供了一种非常有前途的途径。

软骨损伤中软骨和软骨下的结构和功能修复仍然是一个主要的科学和临床挑战，由于它们不同的愈合能力和组织整合特性、软骨和骨之间的密切相互作用、沿结构轴的动态梯度变化以及不同的组织发育阶段。

转录组测序 mRNA-seq

技术服务由伯豪生物提供

1. 定制微凝胶，以及在定制微凝胶的软骨和成骨分化

为了给MSC在软骨和成骨分化提供合适的微环境，将透明质酸(HA)和羟基磷灰石(HYP)分别加入到基于凝胶化的前体溶液中，经冷冻、铺板、洗涤和冻干后形成CH-微凝胶和OS-微凝胶。将MSCs接种到定制的CH-微凝胶和OS-微凝胶中，然后分别在成软骨和成骨诱导培养基中培养7天，形成预分化的负载细胞的定制微凝胶。预分化的软骨和成骨微凝胶依次沉积成两层，通过自组装形成骨软骨类器官。

2. 将定制的微冷冻凝胶自组装成骨软骨类器官

将CH-微凝胶和OS-微凝胶分别进行7天的软骨和成骨分化诱导，然后将预分化的微凝胶移液到4 mm长的网状框架中，接着在混合骨软骨诱导培养基中培养7天(软骨分化:成骨分化= 1:1)。在试管内预分化微凝胶自组装成软骨类器官。

3. 定制的微冷冻凝胶直接决定了MSC的命运

在软骨形成诱导7天后，比较在对照微凝胶和CH-微凝胶中生长的MSCs。共发现4408个差异表达基因(DEGs，包括1615个下调基因和2793个上调基因）。为了更好地了解DEGs在软骨再生中的GO功能，将其分为:软骨细胞调节和免疫调节。软骨细胞增殖的GO项显著上调，免疫反应相关下调，如对白细胞介素-1的反应、白细胞迁移、炎症反应的调节和T细胞介导的免疫等。KEGG富集分析显示，有3条通路上调，包括hedgehog、rap1和p53信号通路，还有8条与免疫调节和软骨细胞肥大相关的通路下调，包括TGF-β、PI3K-Akt和MAPK信号通路。进一步探索SOX9的GSEA，发现在骨重塑、骨吸收、胶原分解代谢过程、成纤维细胞增殖负调控、I型干扰素介导的信号通路负调控等方面均有下调，在急性炎症反应和t细胞稳态正调节。

在成骨方面，在成骨诱导7天后，比较了在对照微冷冻液和OS微冷冻液中生长的MSCs。分析共2158个下调的DEGs和3213个上调的DEGs。GO分析发现10个上调的GO术语与成骨细胞分化、骨化、骨发育、骨生长和骨矿化有关。PPI分析显示了骨再生相关通路的显著聚集，如软骨细胞分化、软骨发育和TGF-β受体信号通路。KEGG分析显示，与骨发育(包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt信号通路)和免疫调节(mTOR、TNF和IL-17信号通路)相关的通路显著上调，而凋亡相关的p53信号通路显著下调。GSEA分析显示，COL1A在MAPK活性的激活、骨细胞发育、TGF-β产生和血管相关平滑肌收缩中上调，在巨噬细胞迁移的调节中下调。RUNX2在脂肪酸β氧化的调节和对TGFβ的反应中上调，在单核细胞分化，正向调节破骨细胞分化，正向调节调节性t细胞分化中下调。

4. 自组装骨软骨类器官对体内骨软骨缺损的影响

采用比格犬股骨缺损模型，研究了预分化定制微冷冻凝胶自组装形成的软骨类器官对体内治疗骨软骨缺损的影响。注释定制的微凝胶后立即完全填充缺损，随后原位自我定向组装成软骨类器官。术后6个月，对照组的比格犬表现出明显的跛行，而微凝胶治疗组表现出步态的明显改善，尽管有轻度的残余跛行。骨软骨类器官干预组表现出标准步态。MRI 图像（红色箭头表示修复组织的区域）显示术后3个月，所有缺损组均未被新组织完全填充，软骨下骨也出现一定程度的炎症和水肿。在对照微凝胶和软骨类器官组中观察到更连续的修复组织信号。在12个月时，软骨下骨的水肿在未治疗的对照组和对照组微凝胶组中仍然明显，但在软骨类器官组中几乎完全消失。此外，缺损仅在软骨类器官组中被完全填充，显示出与周围正常软骨相比具有高度相似性的光滑和均匀的修复组织。