Ni Smart Beads 6FF的预装柱说明书

货号：YA2401

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产品说明：

    Ni Smart Beads 6FF是利用 Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化，适用于 His 标签蛋白及与 Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。强结合的 Ni2+可以直接用于真核表达系统分泌表达的 His 标签蛋白且耐受更高的还原剂、螯合剂，无需进行样品前处理；介质的清洗再生工作简单，无需脱镍直接进行 NaOH 清洗。 

特点如下：

A.快速、简单（一步纯化）。

B.耐受更高的还原剂、螯合剂，真核分泌表达的 His 标签蛋白无需前处理即可上样，最大限度的保护蛋白活性。c.无需脱镍直接进行 NaOH 清洗，大大缩短了清洗周期。

C.镍脱落比传统Ni NTA Sepharose 6FF和Ni Beads 6FF(IMAC）更低，无需反复再生。

表1：介质性能参数

纯化流程：

1、Buffer 的准备 

液配制（如果是包涵体纯化，在下述平衡液、洗杂液、洗脱液中添加 8M 尿素或 6M 盐酸胍）

平衡液：0.02M PB、0.5M NaCl，调节 pH 7.4，室温保存。备注：平衡液中 NaCl 是为了抑制介质的离子交换作用。

洗杂液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.005-0.01M 咪唑，调节 pH 7.4，室温保存。

备注：根据最终使用需求：非变性样品纯化时，在洗杂液中加入 0.005-0.01M 咪唑（优先考虑回收率）或者直接在平衡液中加入 0.005-0.01M 咪唑（优先考虑纯度）；变性样品纯化时，平衡液中建议不可加入 0.005- 0.01M 咪唑，否则结合强度、载量均会有一定的下降。

洗脱液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M 咪唑 ，调节pH 7.4，室温保存。

备注：一般情况下，洗脱液中咪唑浓度在 0.02-0.10M 即可洗脱下目标蛋白。

2、样品准备 

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。 

样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

备注：蛋白的结合能力随着裂解物类型、目标蛋白性质、流速、pH 变化而变化，低流速常常能增加样本的结合效率。

3、样品纯化 

1. 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2. 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出存储缓冲液。

3. 使用至少5倍柱床体积的结合 Buffer 平衡色谱柱。1ml 预装柱推荐流速为 0.5ml/min,5ml 预装柱推荐流速为2ml/min。

备注：此步骤用于平衡介质，保证介质中的溶液的组分和 pH 与样本一致。

4. 利用泵或注射器上样。

注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5. 用洗杂Buffer冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

6. 用洗脱Buffer采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。

7. 依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

4、SDS-PAGE检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

填料清洗 

清洗后可以去除一些强结合性物质（例如一些强结合的蛋白、变性蛋白、脂类等），从而达到恢复介质的优良性能（例如载量、流动性、柱效等）。

建议每使用 5-10 次后进行一次清洗，具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整。

A、用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗。

备注：用于去除洗脱液（使用后直接清洗）或 20%乙醇（使用前清洗）。

B、用 5-10 倍柱体积 1M NaOH 后静置 0.5-1 小时，再用 10-20 倍柱体积纯化水冲洗直至 pH 至中性。

备注：用于去除聚集在介质中的沉淀蛋白或疏水性结合蛋白或脂蛋白等。

C、用 5-10 倍柱体积的 20%乙醇冲洗后保存。

备注：20%乙醇可以防止微生物的生长，20%乙醇保存的介质可以在 4-30℃（4-8℃更佳）保存

常见问题

表1：常见问题及解决方案