一、实验流程

注：目的片段PCR扩增时，通过引物设计时在5’端引入特定的酶切序列，图中以蓝色片段代替

5.1.制备PCR产物

    5.1.1设计扩增引物

引物设计原则：

1）确定目的片段中不含有GGTCTC酶切位点。

2）目的片段设计引物：PCR引物包括目的片段特异引物序列和酶切位点序列（注：目的片段的引物设计遵循引物设计原则即可）

   正向引物（5’-3’）： GGGGggtctctagtg +目的片段正向特异性引物序列

   反向引物（5’-3’）：GCCGggtctcgtggg+目的片段反向特异性引物序列

    5.1.2 插入片段PCR扩增

目的片段PCR时注意事项：

1）酶的选择：插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾。但推荐使用高保真聚合酶进行扩增，以减少扩增突变的引入。

2）反应条件：根据引物的退火温度及目的片段大小确定PCR反应程序。

3）建议进行PCR产物纯化。如果PCR片段是从质粒模板扩增的，且该质粒与重组载体具备相同的抗性，建议将PCR体系中的质粒模板用DpnI进行消化。

5.2.  如意连反应体系

5.3. 连接反应

    体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。37℃反应10 min（亦可在室温条件下进行反应，但克隆数会减少数倍，而克隆正确率不会变化，建议尽量在37℃条件下进行反应），待反应完成后，可将反应产物直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

5.4.  重组产物转化、涂板

1） 取10 μl连接反应液，加入到100 μl感受态细胞中，将溶液混匀，冰上放置30 min。

2）42℃热激45秒，冰水浴孵育5 min。

3) 加入500 μl SOC培养基，37℃摇菌30 min。

4) 4000rpm离心5min，弃上清，留100 μl将沉淀打散，将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上。将平板倒置，于37℃培养12-16小时。

5.5.  阳性克隆鉴定

   1）测序：直接将2-3个细菌克隆，送给测序公司，使用通用引物进行测序。

   2）限制性内切酶酶切鉴定法：挑选2-3个细菌克隆接种于卡那霉素的液体培养基中，过夜培养。使用质粒抽提试剂盒提取质粒，根据载体信息选择适宜的限制性内切酶进行酶切鉴定。

l   Tips

1. PCR产物纯化后连接效率会更高。

2.提高PCR产物浓度，连接效率会更高。

3.在建议温度范围内（22-37℃），提高温度有助于提高连接效率。冬季室温较低，建议在水浴锅内37℃反应增加克隆数。

4.在第一次使用如意连试剂盒时，建议把试剂盒中的control insert也按说明书进行操作，完成连接反应，保证操作没有问题。