产品介绍

膜联蛋白（Annexins）是一类钙离子依赖性磷脂膜结合蛋白家族。其中，膜联蛋白V（Annexin V）作为细胞凋亡研究的重要工具，能够特异性识别细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）——这一特征不仅存在于细胞凋亡过程，也可见于其他形式的细胞死亡。

在凋亡过程中，PS会从细胞膜内侧翻转至外侧。这种细胞表面PS的暴露是凋亡早期/中期的普遍标志，其可检测性甚至早于细胞形态学变化的发生。目前，细胞活性的监测可通过多种参数实现，而基于膜联蛋白V-荧光染料偶联物（Annexin V-dye conjugates）的PS外翻检测法已成为凋亡监测的金标准。

生物素标记膜联蛋白V偶联探针（Annexin V-Biotin conjugate probe）是目前灵敏度最高的膜联蛋白V偶联物之一，与各类荧光标记链霉亲和素（streptavidin）联用时，可实现对细胞凋亡的高效监测

操作步骤摘要

1.制备含测试化合物的细胞样本（200 µL/样本）

2.加入膜联蛋白V偶联物检测溶液

3.室温避光孵育30-60分钟

4.使用流式细胞仪或荧光显微镜进行分析

储存与处理条件

荧光标记膜联蛋白V偶联物储存于含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH 7.4)中。为保持稳定性，建议-20℃避光保存，避免反复冻融（可能影响蛋白完整性）。在推荐条件下可稳定保存至少6个月。 

标准实验方案

膜联蛋白V偶联物细胞孵育步骤

1.配制膜联蛋白V结合缓冲液：10 mM HEPES，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl₂，pH 7.4

2.用测试化合物处理细胞诱导凋亡（如：Jurkat细胞用星形孢菌素处理4-6小时）

3.离心收集细胞（1-5×10⁵细胞/管）

4.用200 μL膜联蛋白V结合缓冲液重悬细胞

5.加入2 μL膜联蛋白V偶联物

（可选）加入死细胞染料如碘化丙啶（货号17585）标记坏死细胞

6.室温避光孵育30-60分钟

7.在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μLAnnexin V缀合测定缓冲液（来自步骤1）以增加体积

8.使用流式细胞仪或荧光显微镜检测荧光强度

流式细胞仪检测

使用匹配滤光片的流式细胞仪定量膜联蛋白V结合情况

注：贴壁细胞因收获过程可能损伤膜结构，常规不建议用于流式检测。但Casiola-Rosen等已建立相关实验方法。

荧光显微镜检测

1.从步骤6中吸取细胞悬液，使用膜联蛋白V结合缓冲液（步骤1）洗涤1-2次，随后用相同缓冲液重悬细胞。

2.将细胞悬液滴加至已覆盖盖玻片的载玻片上。

注：对于贴壁细胞，建议直接在盖玻片上进行培养。

3.完成膜联蛋白V偶联物孵育（步骤6）后，用膜联蛋白V结合缓冲液（步骤1）洗涤1-2次，并重新加入该缓冲液至盖玻片。

4.倒置载玻片观察细胞。也可在膜联蛋白V偶联物孵育后，使用2%甲醛固定细胞，并通过配备相应滤光片组的显微镜进行观察。