成 份

编号

塑料袋包装

MMLV 逆转录酶，200U/μL

60905a

50 μL（绿盖）

5×RT Buffer

60905b

1 mL（本色盖）

使用手册

60905sc

1 份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有限期一年

使用方法

一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

成分

加入量

自备 RNA 模板

总 RNA

100-500 ng

或 poly(A) mRNA

10-500 ng

或专一的 RNA

0.01pg-500ng

注意：RNA 样品不能有基因组 DNA 污染。

自备引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL)

1 μL

或随机引物(0.2ug/μL)

1 μL

或 RNA 模板专一性引物

15-20pmol

注意：随机引物于  RNA  模板的比例跟最后得到的

cDNA  的平均长度成反比。

自 备 RNase-free 水

补水到 12 μL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 再严格按下表顺序加入各成分：

5×RT Buffer 4 μL

自备 RNase Inhibitor (20U/μL) 1  μL自备 dNTP (10 mM each)2 μL

4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成

45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5

分钟）。

5. 加入 1  μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为 20μL。

6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。

7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

二：合成建文库用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 严格按下表顺序加入各成分：

4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成

45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5

分钟）。

5. 加入 1  μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为 20μL。

6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。

7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以

用于第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃。

储存 Buffer：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，0.1 M NaCl，1