病毒转染法是什么？
转染是指将外源基因导入真核细胞内的一种实验技术，随着科技的发展目前可分为三大类：物理介导、化学介导、生物介导。物理介导方法包括电穿孔法、显微注射及基因枪法；化学介导方法常见的有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、阳离子物质介导等；生物介导方法包括原生质体转染和应用较为广泛的病毒载体介导转染技术。
病毒转染法是指在病毒的基础上加以改造，使病毒载体能够携带特定的外源目的基因，将其包装成病毒颗粒后，通过侵染宿主细胞，使外源基因导入到细胞内。与传统方法相比，病毒转染在真核细胞中效率更高，尤其适用于常规方法难以转染的原代细胞、活体细胞等。
Ⅰ、慢病毒载体简介
慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-Ⅰ）作为基础设计出的病毒转染载体，为二倍体RNA病毒，属于逆转录病毒的一种。
HIV-Ⅰ基因组示意图
慢病毒进入宿主细胞中后通过自身反转录酶作用，将病毒RNA反转录成cDNA。随后利用cDNA作为模板，产生双链DNA。经过双链DNA的环化反应及病毒整合酶的作用，使得外源基因能够在宿主细胞染色体上进行整合及稳定表达。
HIV复制过程示意图
Ⅱ、慢病毒载体的优势
1. 表达时间长：慢病毒载体能够将外源基因整合到宿主细胞基因组上，随着宿主细胞的增殖进行稳定表达，不容易丢失，因此常用于构建稳转细胞系。
2. 安全可靠性高：目前暂未发现致病性，可用于基因治疗中。
3. 宿主范围广，免疫原性低：慢病毒载体能够有效感染肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞等多种原代细胞及大部分细胞系。
Ⅲ、慢病毒包装简要流程
慢病毒包装流程示意图
✦✦01 载体构建
在HIV-Ⅰ载体进行构建时，为了防止有复制能力的病毒形成，将HIV-Ⅰ的基因组拆分到各个质粒内，使这些质粒共转染细胞之后只具有一次感染细胞的能力，而不产生具有复制能力的HIV-Ⅰ病毒颗粒。目前应用较为广泛的是三质粒表达系统，包括包装质粒、包膜质粒、目的质粒。
三质粒表达系统载体结构示意图
✦✦02 细胞准备
转染前一天，胰酶消化传代至培养皿，并使细胞贴壁后生长至密度达到80%-90%。在细胞培养的过程中，需要注意支原体污染问题。被支原体污染的细胞，细胞形态不会发生明显的变化，培养基也不会发生浑浊，因此不容易被发现。但支原体会对细胞的生长状态、免疫、代谢、病毒增殖和感染率等多方面造成影响。
支原体污染可通过PCR方法进行检测，biodragon支原体检测试剂盒（货号：BDXB0087）灵敏度高、操作简单、检测范围广，通过对支原体基因组保守区域设计引物，利用PCR技术，可检测多种常见的支原体。
常见支原体PCR扩增产物大小（bp）
通过PCR扩增，若出现阳性条带，则细胞有可能受到支原体污染，此时可选择biodragon支原体清除试剂盒（货号：BDXB0112），本品含有两种抗支原体成分，对多种不同的细胞系的支原体污染都有很强的清除功效，并且对正常细胞的生长无影响，其作用机理是通过干扰支原体DNA复制、干扰核糖体的转录来抑制支原体蛋白质的合成来达到清除支原体的目的，可用于实验室以及疫苗生产中所培养细胞的支原体污染的清除及预防。
✦✦03 共转染细胞
包装质粒、包膜质粒、目的质粒共转染293T细胞，5%CO2恒温培养箱37℃孵育。
三质粒系统转染示意图
✦✦04 收获病毒
孵育细胞18h后更换培养液以去除转染试剂，继续培养24h后收获上清病毒液，同时更换新鲜的收获培养基，继续培养24h后，二次收获病毒上清。每隔12h可重复上述病毒收获过程，一般可以收集2-3次病毒，收集的病毒上清可根据需要进行合并。
✦✦05 慢病毒的浓缩及纯化
为了使慢病毒载体具有更强的细胞感染能力，一般我们需要对收集的病毒上清进行浓缩和纯化，常见方法有以下两种：
方法一：超速离心沉淀法
（1）收集细胞培养上清液，0.45μm 滤膜过滤，去除细胞和碎片。
（2）4℃，50000g高速离心2h，小心弃去上清后晾干，按照200ul/10cm培养基的比例加入PBS重悬沉淀，室温静置2h，用移液枪轻轻吹匀，室温放置30min。分装病毒至1.5ml离心管中，-80℃保存。
方法二：biodragon慢病毒浓缩试剂（货号：BF06205）
（1）收集细胞培养上清液，0.45μm 滤膜过滤，去除细胞和碎片。
（2）将慢病毒上清液与试剂盒中的浓缩液按照体积比4:1的体积混合（上清液4份，浓缩液1份），混匀后4℃ 静置，每隔30min 混匀一次，混匀共进行3次。4℃孵育2h 或过夜。
（3）4℃，4000g 离心30min。
（4）小心去除上清，不要剧烈晃动管子，一般可见白色沉淀（有时沉淀不可见）。
（5）用初始体积（原上清液体积）1/10 - 1/100的 DMEM 或 PBS 重悬病毒颗粒，小心吹打均匀，重悬沉淀物。
（6）重悬后的病毒以50μl/管分装，-80℃冰箱保存。
✦✦06 慢病毒滴度测定
病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒数量，滴度值可用于评估转导一定数量的靶细胞所需的病毒量，常见方法有以下几种：
（1）荧光染色法：慢病毒进行抗原-抗体显色反应或通过慢病毒载体上携带的荧光标签，利用荧光显微镜在相应的激发光波长下观察荧光表达的情况。
（2）实时荧光定量PCR技术：利用基于SYBRGreen的实时荧光定量PCR技术，通过标准曲线对未知模板进行定量。通过Ct值与标准曲线对模板进行定量分析，并根据公式计算慢病毒滴度。
实时荧光定量PCR仪及qPCR结果图
（3）ELISA检测P24蛋白：P24蛋白是慢病毒外壳中含量最高的标志性蛋白，理论上检测p24蛋白就可以对慢病毒滴度进行定量。根据此原理设计了biodragon慢病毒滴度ELISA检测试剂盒（货号：BF06203），通过双抗体夹心法可定量检测HIV-Ⅰ p24蛋白含量，适用于血清、培养上清等多种样品中的慢病毒滴度检测。
（4）慢病毒滴度快速检测卡
Biodragon慢病毒滴度快速检测卡（货号：BF06202）是基于胶体金侧向层析技术的 HIV-Ⅰ P24蛋白半定量检测卡，可以用于相关慢病毒载体和假病毒包装效率的快速评估。当样品中 P24浓度变化时，检测线颜色的深浅与 P24浓度呈正相关。仅需20ul细胞培养上清，静待10-15min后，通过与比色卡比较，可半定量待检标本中P24蛋白浓度，并大致估算慢病毒的滴度。
检测卡显色样式
✦✦07 慢病毒感染目的细胞
经过上述验证，合格的慢病毒可用于感染目的细胞，若病毒感染效率不高，可选择biodragon慢病毒感染增强试剂（货号：BDXB0113），产品可有效增强慢病毒对细胞的感染效率，且对细胞毒性极小。经 T 细 胞、MCF7、Raji 等多类细胞验证结果表示，增强效果比不使用助感染试剂强 5-10 倍，本品增强效果优于 polybrene。
慢病毒增强试剂效果测试
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